Die Geschichte der Hox-Gene

Homeotische Mutationen: Darwin hatte 1859 sein Werk "Die Entstehung der Arten" publiziert. Damals war über Genetik praktisch nichts bekannt. (Mendel veröffentlichte seine Untersuchungen 1865 in einer wenig bekannten Zeitschrift und seine Ergebnisse blieben bis zur Wiederentdeckung 1905 durch Correns und Czermak praktisch unbekannt). Man hatte keine oder falsche Vorstellungen von der Vererbung. Daher konnte Darwin auch nicht erklären, wie genetische Variation zustande kommt. Das war ein ganz zentrales Manko seiner Theorie zu dieser Zeit. Um der Lösung dieser Frage näher zu kommen, beschäftigte sich William Bateson mit der phänotypischen Variation der Tiere und versuchte sie zu klassifizieren. Er berichtete davon in seinem Werk: Materials for the study of variation, Mc Millan 1894, London. Er führte den Begriff Homeosis für eine Klasse ganz besonderer Mutationen ein. Beispiele dafür führt Bateson von Insekten an (s. Abb. 1), bei denen z.B. displazierte Körperanhänge auftreten (z.B. wenn statt der Antenne ein Bein oder statt eines Beines ein Flügel ausgebildet wurde, bei Wirbeltieren gab es Fälle, dass z.B. statt eines Halswirbels ein Brustwirbel gebildet worden war, der eine zusätzliche Rippe aufwies u.ä.

Abb.1  Homeotische Mutationen

A: Der äußere Teil einer Antenne eines Insektes ist beinartig (s. Pfeil). D.h. ein vorderer Körperteil ist durch einen weiter hinten liegenden Körperteil ersetzt.

B: Der Schmetterling weist 5 Flügel auf, ihm fehlt rechts hinten ein Bein, was hier nicht zu sehen ist. Ein ventraler Teil des Körpers ist also in einen dorsal liegenden verwandelt worden. 

C: Ein Auge des Krebses ist durch eine Antenne ersetzt (s. Pfeil).

Postulierung homeotischer Gene: Nach der Wiederentdeckung der Mendelschen Vererbungsregeln erkannte Bateson sofort ihre große Bedeutung und interpretierte seine oben beschriebenen Phänotypveränderungen als homeotische Mutationen. So interpretierte er eine bestimmte Art der Kurzfingerigkeit nicht als Verkürzung der einzelnen Finger, sondern als Ausbildung mehrerer Daumen. Entsprechende Erklärungen gab er für die Ausbildung von Blütenblättern anstelle von Staubblättern bei Pflanzen ab usw.
Der definitive Beweis dafür, dass es solche Gene tatsächlich gibt, gelang dann Bridges in Morgans Laboratorium, in dem man begonnen hatte Drosophila intensiv zu untersuchen. Er fand unter den Mutanten ein Tier, bei dem die Halteren durch ein zweites Flügelpaar ersetzt waren. D.h. das 3. Thoraxsegment T3 war in das 2. Thoraxsegment T2 transformiert worden. Er konnte nachweisen, dass nur ein Gen mutiert war. Diese Mutation wurde fortan als bithorax (bx) bezeichnet und die Mutanten wurden als Stamm weiterhin gehalten.

Der Bithorax-Komplex: Die bithorax-Mutation bx war Ausgangspunkt für die genetische Untersuchung des bithorax-Komplexes (BX-C) durch Edward Lewis. 1978 veröffentlichte er zusammenfassend seine Ergebnisse dazu. Dieser Komplex besteht aus mehreren Genen, die nebeneinander liegen. Da sie in ihrer Sequenz große Ähnlichkeiten besitzen, glaubte Lewis, dass sie durch Duplikationen (Verdopplungen) entstanden sind und anschließend durch Mutationen sich auseinander entwickelt haben. Fehlte der gesamte Komplex (Deletion), so entstanden letale Mutanten, die sich jedoch im Larvenstadium so weit entwickelten, dass man erkennen konnte, das alle hinter T2 liegenden Segmente fehlten (s. Abbildung 2).
 
Abb. 2 Auswirkungen einer Deletion, bei der der bithorax-Komplex (BX-C) fehlt. 

a: Hier ist der Wildtyp der Larve von Drosophila dargestellt. Aus T1 bis T3 gehen die drei Thoraxsegmente des erwachsenen Tieres hervor. Aus A1 bis A8 werden die verschiedenen Abdominalsegmente gebildet. Sie sind bei der Larve durch ein ganz typisches Dentikelmuster charakterisiert (die weißen Pünktchen). 

b: Fehlt dem Tier der bithorax-Komplex im Erbgut, so fehlen der Larve sämtliche Abdominalsegmente sowie T3. Die Larve kann sich nicht zu einem lebenden erwachsenen Tier entwickeln.

Daher hielt Lewis diesen Zustand (T2) für den Grundzustand, der durch andere Gene in den jeweils benötigten Zustand (A1 bis A8) überführt wird. Er meinte dann, dass für jedes weitere Segment ein Gen zuständig sei. Dieses Modell sah zunächst folgendermaßen aus (ist später verändert worden): Für jedes Segment gibt es ein Gen. Dieses Gen wird in dem entsprechenden Segment, für das es zuständig ist, exprimiert und zusätzlich in allen dahinter liegenden Segmenten. Weiter stromabwärts (in Richtung der Ablesung bei der Transcription) liegende Gene werden weiter hinten exprimiert (sog. Kolinearität der Gene mit der Expressionssequenz auf der DNA). Dieses Modell ließ folgende Voraussagen zu:
1. Eine Mutation eines der Gene muss rezessiv sein. Denn ist ein Allel des Gens mutiert, so wird das regulative Protein noch vom 2. Allel gebildet und die Mutation dürfte sich phänotypisch nicht auswirken.
2. Sind beide Kopien des Gens mutiert, so übernimmt das vor ihm liegende Gen die Kontrolle. Es müsste also eine weiter hinten liegende Struktur durch eine weiter vorn liegende ersetzt werden, was auch der Fall ist (man denke an bithorax, was als Beispiel genommen werden kann). Solche Mutationen werden loss-of-function Mutationen genannt, weil die eigentliche Funktion verloren gegangen ist.
3. Wird ein Gen, das eigentlich nur in einem hinteren Segment exprimiert werden sollte, in einem vorderen Segment exprimiert, so kommt es zu einer dominanten Mutation, weil ja jetzt weiter vorn das regulative Protein gebildet wird, was ansonsten erst weiter hinten exprimiert werden würde. Es handelt sich dann um eine gain-of-function Mutation, weil jetzt das Gen eine Funktion übernimmt, die sonst nicht ausgeführt würde. Ein Beispiel dafür ist die Antennapediamutation (an Stelle der Antenne wird ein Bein ausgebildet).
Die Voraussagen des Modells konnten alle bestätigt werden.

Das Antennapediagen und der ANT-C: Gehring interessierte sich besonders für die Antennapedia-Mutation bei Drosophila. Das ist eine Mutation bei der die Antenne am Kopf, durch ein Bein des zweiten Brustsegmentes ersetzt ist. Es treten allerdings verschiedene Varianten dieser Mutation auf. Die erste wurde von Elizaveta Balkaschina 1929 beschrieben. Sie hatte die von ihr entdeckte Variante der Mutation aristapedia genannt, weil ein federförmiger Anhang auf der Antenne, die arista, beinähnlich ausgebildet war (also kein vollständiges Bein). Die erste Mutation, bei der die Antenne durch ein vollständig ausgeprägtes Bein ersetzt war, wurde von Calvarez 1948 entdeckt. Diese Form der Mutation wurde später von Gehring Nasobemia getauft nach einem Gedicht von Christian Morgenstern, in dem Tiere beschrieben werden, die auf der Nase laufen. Gerolf Steiner hat darüber unter dem Pseudonym H. Stümpke eine fiktive wissenschaftliche Abhandlung über die sog. Rhinogradentia geschrieben. Das Gedicht von Morgenstern lautet:

    Auf seinen Nasen schreitet
    einher das Nasobem,
    von seinem Kind begleitet.
    Es steht noch nicht im Brehm.
    Und auch im Brockhaus nicht.
    Es trat aus meiner Leyer
    zum erstenmal ans Licht.
    Auf seinen Nasen schreitet
    (wie schon gesagt) seitdem,
    von seinem Kind begleitet,
    einher das Nasobem.

Die Homeobox und die Homeodomäne: In den 70er Jahren wurden die Methoden der rekombinativen DNA Technologie entwickelt. Dazu gehören vor allen die verschiedenen Restriktionsenzyme, mit denen sich DNA in kleine Stücke schneiden lässt, Plasmide und Viren, in die diese Stücke eingesetzt werden können, sowie die Möglichkeit die Plasmide wieder in Bakterien einzuführen und zu vermehren, wodurch das Gen, das in dem Plasmid enthalten ist, geklont wird. So können große Mengen eines einzelnen Gens gewonnen werden und damit anschließend sequenziert werden.

Außerdem hatte man das Enzym reverse Transcriptase entdeckt, das RNA in DNA umschreibt. Mit seiner Hilfe ist es möglich mRNA in DNA umzuschreiben, diese in ein Plasmid einzusetzen und zu klonieren. Ein solches DNA-Stück wird cDNA genannt (von copy DNA, diese DNA enthält also keine Introns, entspricht also nicht dem Gen im Erbgut).

Um ein Gen zu isolieren brauchte man damals noch irgendwelche Informationen über die Genprodukte, z.B. die Sequenz der mRNA oder etwas Ähnliches. Für homeotische Gene verfügte man aber nicht über solche Informationen, so dass neue Methoden erforderlich waren, wenn man sie finden und sequenzieren wollte. Nachdem die Klonierung von Genen möglich war, hatte Gehring damit begonnen, eine Genbibliothek von Drosophila anzulegen.

Eine solche Genbibliothek besteht aus tausenden verschiedener Plasmide, die alle eine unterschiedliche kurze DNA-Sequenz von Drosophila enthalten. Von Hogness wurde dann die Methode des Chromosomen-walking entwickelt, um die Sequenz eines bestimmten Gens zu finden. Diese Methode besteht darin, dass man von einer bestimmten Stelle auf dem Chromosom, deren Sequenz man kennt, die daneben liegende in einer Genbibliothek finden kann, indem man diese Sequenz mit der Bibliothek hybridisiert und so nach Sequenzen sucht, die eine Überlappung mit der Ausgangssequenz aufweisen und so kann man fortfahren.

Ist man eine ganze Strecke "gewandert", kann man durch in vivo Hybridisierung herausfinden, wo diese letzte Sequenz im Chromosom lokalisiert ist. Mit dieser Methode war es Hogness gelungen, das Ultrabithoraxgen aus dem Bithoraxkomplex zu isolieren und zu klonen. Gehring hatte sich immer außerordentlich für das Antennapediagen interessiert und nahm sich nun vor, dieses mit derselben Methode zu isolieren. Die Einzelheiten dieses Unternehmens sollen hier nicht geschildert werden, aber es war ein sehr aufwendiges langwieriges Stück Arbeit, das fast 4 Jahre in Anspruch nahm.

Als das schließlich erreicht war, stellte ein Mitarbeiter von Gehring eine cDNA vom Antennapediagen her und hybridisierte es in vivo mit dem gesamten Erbgut von Drosophila. Dabei trat das überraschende Ergebnis auf, dass diese DNA-Sequenz auch mit DNA-Sequenzen außerhalb des Antennapediagens hybridisierte.

Ein Gen an das die Antennapedia-cDNA hybridisierte war das fushi tarazu Gen (ftz), das kurz zuvor isoliert worden war. Dabei handelt es sich um ein Gen, das dazu führt, dass zu wenig Segmente ausgebildet werden, wenn beide Allele mutiert sind. Daher wurde nun dieses Gen kloniert, um es mit dem Antennapediagen vergleichen zu können. Es stellte sich dann heraus, dass beide Gene eine vergleichbare Sequenz im letzten Exon besitzen. Um herauszufinden, ob diese Sequenz eine bestimmte Bedeutung hat, wurde eine in vivo Hybridisierung des Erbgutes mit dem letzten Exon vorgenommen. Dabei stellte sich heraus, dass die Sequenz mit etwa 12 weiteren Genen hybridisierte.

Da das Ultrabithoraxgen aus dem Bithoraxkomplex ja schon kloniert war, konnte man prüfen, ob es auch so eine Sequenz enthielt. Und siehe da, das war tatsächlich der Fall und ebenfalls im letzten Exon! Damit war Gehring klar, dass sie hier etwas sehr Wichtiges entdeckt hatten. Sie gaben daher der Sequenz den Namen Homeobox.

Aus der Sequenzierung ging dann hervor, dass die zugehörige DNA-Sequenz aus 180 Nukleotiden besteht, der 60 Aminosäuren entsprechen, die in den zugehörigen Proteinen die sog. Homeodomäne codieren. Die Funktion dieser Domäne war allerdings zu diesem Zeitpunkt noch völlig unbekannt.

Dass es zwischen verschiedenen Proteinen Sequenzähnlichkeiten gibt, ist an sich noch nichts Besonderes, aber dass diese hier in homeotischen Genen lagen, versprach zu einer aufregenden Sache zu werden. Daher wurde eine Hybridisierung dieser Sequenz mit dem Erbgut von Drosophila und auch anderen Organismen vorgenommen. Schon kurz darauf fanden sich zwei weitere Gene Deformed (Dfd) und abdominal-A (abdA), die beide durch homeotische Mutationen bekannt waren. Gehring, der diese Befunde mit DeRobertis diskutierte, beschloss zu untersuchen, ob es auch homologe Sequenzen zur Homeobox bei anderen Tieren gibt. DeRobertis und McGinnies fanden dann tatsächlich ein solches Gen bei Xenopus.

Dieser Befund machte Schlagzeilen, weil nun die Möglichkeit bestand, dass es bei Insekten und Wirbeltieren ähnliche Prinzipien der genetischen Kontrolle der Entwicklung gibt. Daher stürzten sich viele Untersucher auf dieses Thema und schon bald waren Homeoboxgene in der Maus und sogar beim Menschen entdeckt und isoliert.

Nun wurde es natürlich Zeit herauszubekommen, welche Funktion dieser Domäne zukommt. Dazu wurden Sequenzvergleiche mit allen computergespeicherten Sequenzen vorgenommen. Shepherd fand dann eine geringe aber signifikante Sequenzhomologie zum mating-Protein von Hefe. Von diesem Protein war bekannt, dass es ein regulatorisches Gen ist und dass es einen Repressor codiert. Das war der erste Hinweis darauf, dass die homeotischen Gene Transcriptionsfaktoren codieren könnten. Transcriptionsfaktoren sind Proteine, die eine Domäne besitzen mit deren Hilfe sie sich an ganz bestimmte Stellen der DNA binden und dort ganz bestimmte Gene aktivieren.

Lewis hatte gedacht, dass der BX-C-Komplex aus 8 Genen besteht, die jeweils für eines der Abdominalsegmente verantwortlich sind. Nun, da die entsprechenden gentechnologischen Möglichkeiten zur Verfügung standen, konnte der Komplex genauer analysiert werden. Dabei stellte sich heraus, dass es nur 3 Gene gibt, nämlich Ubx (Ultrabithorax), abdA (abdominal A) und AbdB (Abdominal B). Diese Gene haben aber sehr komplexe regulatorische Regionen. Weiter stellte sich dann heraus, dass das Antennapediagen ebenfalls in einem Genkomplex von 5 Genen liegt, der ANT-C genannt wird (s. Abb. 4).

Wie oben schon angesprochen, wurde auch bei den Wirbeltieren nach homologen Genen gesucht, speziell bei der Maus. Man wurde auch fündig und stellte fest, dass es bei der Maus im Unterschied zu Drosophila vier cluster (Komplexe) von Genen mit einer Homeobox gibt. Diese Gene werden jetzt Hoxgene genannt (s. Abb. 4). Während es nun bei Drosophila zwei getrennt liegende Komplexe, den ANT-C und den BX-C gibt, liegen bei der Maus (und das gilt auch für andere Wirbeltiere und auch für den Menschen) die entsprechenden homeotischen Gene alle in einem Komplex (ein Komplex kann bis zu 13 Genen enthalten). Die Gene in diesem Komplex haben aber ganz ähnliche Eigenschaften wie bei Drosophila. Sie werden zeitlich nacheinander und kolinear zur Körperachse exprimiert.

 

Abb. 4 Vergleich der Hox-Gen-Komplexe bei Drosophila und der Maus
Links: der ANT-C (lab, pb, Dfd, Scr, Antp) und der BX-C (Ubx, abdA, AbdB) bei Drosophila, die im Genom getrennt liegen, was hier nicht dargestellt ist. Die Pfeile weisen auf die Körperstellen, an denen die Gene exprimiert werden. 
Rechts: Die Maus hat vier Hoxkomplexe, die mit HoxA, HoxB, HoxC und HoxD bezeichnet werden. Hier ist nur einer der vier Komplexe dargestellt. Es wird ebenfalls gezeigt, wo die Gene in der Entwicklung exprimiert werden.

Man geht heute davon aus, dass es in der Evolution einen Urcluster von Hoxgenen gegeben hat (Amphioxus hat nur einen cluster) und dass im Laufe der Wirbeltierevolution zwei Genomduplikationen (und damit auch Duplikationen des Urclusters) stattgefunden haben. Der genaue Ursprung der Hoxgene ist noch nicht bekannt.

Bei Drosophila werden die Hoxgene im embryonalen Ektoderm, im Neuroektoderm und im Darmtrakt exprimiert. Dasselbe gilt auch für die Maus und das Küken, wo die Gene im Nervensystem, dem paraxialen Mesoderm und dem Darmsystem exprimiert werden. In allen Fällen gilt die Kolinearität der Expression.

Die überraschendste Beobachtung ist die enorme Konservierung der Hoxgene im Verlaufe der Evolution. Sowohl die strukturelle Organisation, das Expressionsmuster und die Funktionen der Hoxgene sind weitgehend erhalten geblieben. Trotzdem wird nach und nach klar, dass kleinere Abweichungen existieren und dass diese mit Veränderungen der Morphologie korrelieren.

Quellen:

Lewis EB (1978) A gene complex controlling segmentation in Drosophila. Nature 276: 565–570.

Gehring, W.J. Master Control Genes in Development and Evolution, Yale University Press, 1998

Kontakt:: Kontakt: Mario.Hupfeld@uni-konstanz.de

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